Тщательное исследование механизмов реакций, и в частности изучение скорости ферментативного превращения субстрата в конечные продукты при различных условиях, подтвердило это предположение задолго до того, как были получены прямые экспериментальные доказательства образования фермент-субстратных комплексов. Так, например, когда субстрат обладал характерной длиной волны поглощаемого или испускаемого им света (а эта особенность присуща многим органическим соединениям), образование и распад фермент-субстратных комплексов удалось наблюдать при помощи соответствующих оптических приборов — спектрофотометров, регистрирующих изменение длины волны поглощаемого реакционной смесью света. А совсем недавно группа японских исследователей выделила в виде пурпурных кристаллов фермент-субстратный комплекс, образованный ферментом оксидазой аминокислот и его субстратом.

 

Чтобы квалифицированно обсуждать механизм действия ферментов, особенно если учесть, что сами ферменты являются белками, химическое строение которых еще полностью неизвестно, совершенно недостаточно знать, что между ферментом и субстратом образуется комплекс. В настоящее время выяснено, что, несмотря на огромные размеры молекулы фермента, истинный комплекс с субстратом образует только одна небольшая часть его макромолекулы, которая состоит, вероятно, не более чем из 6 – 12 пептидных звеньев. Эта область называется активным центром фермента. Остальная часть молекулы лишь незначительно влияет на протекание катализируемой этим ферментом реакции. При некотором значении pH участок полипептидной цепи фермента, включающий активный центр, приобретает строго определенную конфигурацию; при этом у боковых групп аминокислотных звеньев появляются определенные заряды. В результате в активном центре образуется участок пространства такой формы и с таким расположением зарядов, что молекула субстрата «плотно» укладывается в него, подобно тому, как ключ входит в замок. Электростатические и другие межмолекулярные силы связывают субстрат с активным центром фермента и воздействуют на него таким образом, что молекула субстрата оказывается «активированной» и легко реагирует далее, образуя конечные продукты реакции. Когда субстрат превратится в конечные продукты, они уже не заполняют плотно полость активного центра фермента и «выпадают» в окружающий раствор, освобождая тем самым активный центр для другой молекулы субстрата.

 

 

Зачастую область активного центра фермента не заполняется полностью молекулой субстрата, и тогда для плотной укладки необходимо привлечение других веществ. Наиболее часто ими бывают ионы металлов, особенно ионы магния и марганца, которые, обладая двумя положительными зарядами, могут образовывать связь между белковой цепью фермента и отрицательно заряженной молекулой субстрата. Иногда с ферментом связываются другие вещества, например нуклеотиды, которые также способствуют заполнению активного центра фермента субстратом и тем самым создают возможность для нормального хода данной реакции превращения субстрата. Очень часто ферменты совершенно неспособны катализировать реакции без этих добавочных веществ.

 

Необходимость участия в реакции этих дополнительных веществ (активаторов, или коферментов) легко демонстрируется следующим довольно простым приемом. Раствор активного фермента наливают в целлофановый мешочек, нижнюю часть которого помещают в дистиллированную воду. Через мельчайшие поры целлофановой пленки мешочка свободно проходят молекулы низкомолекулярных веществ, чего нельзя сказать о больших белковых молекулах. В результате через несколько часов жидкость внутри целлофанового мешочка будет содержать только молекулы белка-фермента, а все ионы металлов, нуклеотиды и другие низкомолекулярные вещества выйдут в окружающую мешочек воду. Если активность данного фермента зависит от присутствия в реакционной среде какого-либо из этих низкомолекулярных веществ, то проба раствора фермента, отобранная из мешочка, окажется неспособной катализировать превращение соответствующего субстрата, пока не будет добавлено требуемое вещество. Этот процесс разделения низко- и высокомолекулярных соединений называется диализом. Его часто используют для получения чистых высокомолекулярных веществ, а также для исследования механизмов действия ферментов.

 

 

Итак, веществами, способствующими протеканию ферментативных реакций, то есть кофакторами, часто являются ионы металлов или соединения типа нуклеотидов. Иногда кофермент настолько прочно связан с ферментом, что его не удается отделить диализом; в этом случае кофермент называют простетической группой фермента. И коферменты и простетические группы выполняют одну и ту же функцию: они способствуют специфическому связыванию субстрата ферментом. Перед началом реакции субстрат, фермент и кофактор сближаются, затем все компоненты ферментативной реакции образуют комплекс, в котором происходит активация молекулы субстрата, и, наконец, расщепленная молекула субстрата выходит из активного центра фермента, который готов принять следующую молекулу субстрата.

 

По мере расширения наших представлений о структуре белков мы все больше узнаем о механизмах действия ферментов. Уже известна последовательность чередования аминокислотных звеньев в активных центрах нескольких ферментов. Выяснено, что в строении активных центров разных ферментов одного и того же класса, скажем, таких, как фосфатазы или эстеразы, очень много общего. Для них характерны одно или несколько сериновых звеньев, тогда как в активных центрах ферментов других классов содержатся остатки серусодержащей аминокислоты — цистеина.